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Servicebio 2 × SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)是使用SYBR Green I嵌合熒光法進行qPCR反應的專用2×預混液,包含除引物、DNA模板以外的所有qPCR組分,可減少操作步驟,縮短加樣時間,降低汙染幾率。核心組分為基因工程改造後的熱啟動Taq DNA Polymerase,通過單克隆抗體與Taq DNA Polymerase高效結合,有效地封閉DNA聚合酶活性,阻止低溫下的非特異性擴增,具有特異性強、檢測靈敏度高等諸多優點,配以針對qPCR優化的反應Buffer,非常適合於進行高特異性、高靈敏度的qPCR反應。本產品是一種含有qPCR反應最適濃度SYBR Green I的2×預混試劑,可以在寬廣的定量區域內得到良好的標準曲線,對靶基因定量準確、重覆性好、可信度高。
實驗步驟
1. 推薦PCR反應體系
Component |
20 μL rxn |
50 μL rxn |
Final Concentration |
2 x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
10 μL |
25 μL |
1 × |
Forward Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
Templateb |
Variable |
Variable |
as required |
Nuclease-Free Water |
Add to 20 μL |
Add to 50 μL |
a.通常引物終濃度為0.2 μM可以得到較好結果。反應性能較差時,可以在0.2-1.0 μM範圍內調整引物濃度。
b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷貝數不同而不同,進行梯度稀釋研討適當的模板添加量。在20 μL反應體系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反應的cDNA(RT 反應液)為模板時,添加量不要超過PCR反應液總體積的10%.
2.PCR反應程序(可根據機型適當調整)
A. Two-step process* |
B. Three-step process* |
||||||||
Stage |
Step |
Cycles |
Temperature |
Time |
Stage |
Step |
Cycles |
Temperature |
Time |
Stage 1 |
Predegeneration |
1 |
95℃ |
30 sec |
Stage 1 |
Predegeneration |
1 |
95℃ |
30 sec |
Stage 2 |
Degeneration |
40 |
95℃ |
15 sec |
Stage 2 |
Degeneration |
40 |
95℃ |
15 sec |
Annealing-Extension |
60℃ |
30 seca |
Annealing |
55-65℃ |
10 sec |
||||
extension |
72℃ |
30 seca |
|||||||
Stage 3 |
Melting curve |
1 |
Instrument default Settings |
Stage 3 |
melting curve |
1 |
Instrument default Settings |
*需提高擴增特異性,可使用兩步法程序或提高退火溫度;需提高擴增效率,可使用三步法程序或延長延伸時間。
a:熒光信號采集請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置。
注意事項
1. 使用前請上下輕輕顛倒混勻,請勿渦旋振蕩混勻,避免產生氣泡,試劑混勻後再使用。試劑混合不均勻易造成反應效果不佳;
2. 配制反應液時,試劑請於冰上放置;
3. 本制品中含有熒光染料SYBR Green,配制PCR反應液時應避免強光照射;
4. 反應液的配制、分裝請使用新的一次性槍頭、盡量避免樣品間的汙染;
5. 避免反覆凍融Master Mix,解凍後盡量在一個月內使用完畢。
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