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Servicebio 蛋白免疫沉澱試劑盒 (Protein A Agarose）

商品編號：G2215-50T

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規格：

產品介紹

免疫沈澱或免疫共沈澱是研究蛋白或蛋白之間相互作用（Protein-Protein Interactions，PPIs）的常用技術，通過使用特異性抗體和可結合抗體的介質（如Protein A/G Agarose或Protein A/G Magrose）或直接使用偶聯特異性抗體的介質（如瓊脂糖凝膠或磁珠），通過離心或磁力從溶液中分離出抗原和抗體覆合物，從而達到分離和純化目標蛋白的目的，隨後可用於蛋白免疫印跡（Western Blot）或質譜分析；Protein A是一種發現於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細胞壁表面蛋白，分子量為42 kDa；Protein G是C型或G型鏈球菌(Streptococcal bacteria)表達的免疫球蛋白結合蛋白；Protein A和Protein G功能相似，能特異性地與哺乳動物免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)結合；經重組改造的Protein A、G與瓊脂糖凝膠以一定的方式結合，可用於免疫沈澱；Protein A瓊脂糖凝膠適合於免疫沈澱human IgG1、IgG2、IgG4，mouse IgG2a、IgG2b等，而Protein G瓊脂糖凝膠適合於免疫沈澱human IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，rat IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c等多克隆抗體（具體信息見附表一）。

本產品采用自主研發生產的Protein A蛋白標記瓊脂糖凝膠，與市場上同類產品相比，該產品結合抗體效率更高，非特異性結合率更低，配合優化後的緩沖液，可便捷高效的進行免疫沈澱實驗；可廣泛應用於細胞裂解物、細胞分泌上清、血清、腹水等樣品中目標蛋白的分離與純化；本試劑盒提供兩種洗脫方法（變性洗脫和酸洗脫）對目的蛋白進行洗脫，特別是酸洗脫後不會包含抗體的輕鏈和重鏈，可以有效解決免疫沈澱後蛋白免疫印跡實驗中抗體重鏈和輕鏈的干擾問題。

特點	描述
產品內容	50%(v/v) agarose in specific protective buffer
類型	6% agarose cross-linked agarose
偶聯蛋白	Protein A
偶聯蛋白分子量	~25 kDa（Protein A）
結合蛋白能力	>1mg小鼠抗體 /ml
特異性	來自不同物種的抗體，包括小鼠、人源、大鼠、山羊、棉羊、牛
尺寸	30~150 μm
洗脱方法	酸洗或 1x SDS‐PAGE loading buffer (reduced)洗脫註意：如果使用 1x SDS‐PAGE loading buffer (reduced)洗脫，抗體的重鏈（~50 kDa）和輕鏈（~25 kDa）會從凝膠上變性釋放出來
應用	蛋白免疫沉澱，蛋白純化

內容物

Component Number	Component	G2215-50T	Storage temperature
G2038	IP lysis buffer	50 mL	2-8℃
G0015	10×TBS	5 mL	2-8℃
G2215-1	SweAgarose Protein A	1 mL	2-8℃
G2215-2	Acid Elution Buffer	10 mL	2-8℃
G2215-3	Neulization Elution Buffer	1 mL	2-8℃
G2013	5x SDS-PAGE loading buffer（reduced）	1 mL	-20℃
Manual		1pc

需自行準備之試劑

Product Name	Cat. Number	Spec.
50×Cocktail protease inhibitor	G2006-250UL	250 μL
PBS,1×(Phosphate Buffered Saline)	G4202-500ML	500 mL

實驗步驟

1. 試劑盒的準備：

a) 參照下表，按照每個樣品使用100-500 μL裂解液的比例，準備相關試劑；

Step	Solution Required	Volum	Volum
Cell lysis and preparation	IP lysate containing Cocktail protease inhibitor	100 μL	500 μL
IP	SweAgarose Protein A	4 μL	20 μL
Wash three times	1×TBS	100 μL	500μL
Acid Elution & Neutralisation	Acid Elution Buffer	20 μL	100 μL
Acid Elution & Neutralisation	Neutralization Buffer	20 μL	100 μL
Denaturing Elution	1x SDS-PAGE loading buffer（reduced）	20 μL	100 μL

b) 含蛋白酶抑制劑的IP裂解液的配制：參照上表，按照每50-100萬細胞使用100-200 μL含蛋白酶抑制劑Cocktail的裂解液用於裂解；將IP裂解液與50×Cocktail蛋白酶抑制劑（推薦G2006-250UL）按照50:1的比例混合，例如在1 mL IP裂解液中加入20 μL 50×Cocktail蛋白酶抑制劑，即得1 mL含蛋白酶抑制劑的IP裂解液；配制好的含抑制劑的IP裂解液宜放置在冰浴或4℃；

c) 註意：如果免疫沈澱的目標蛋白涉及磷酸化或乙酰化修飾，需要添加磷酸酶抑制劑或去乙酰化酶抑制劑（自備）；含抑制劑的IP裂解液宜現配現用，不宜配制後凍存並留作後續使用；

d) 1×TBS的配制：將10×TBS緩沖液用超純水稀釋至1×，即為1×TBS；例如1 mL 10×TBS緩沖液加入9 mL超純水，混勻後即為1×TBS緩沖液；

e) 1×蛋白上樣緩沖液（還原型）的配制：取適量5×蛋白上樣緩沖液（還原型）用超純水稀釋5倍即為1×蛋白上樣緩沖液（還原型）；例如0.2 mL 5×蛋白上樣緩沖液（還原型）加入0.8 mL超純水，混勻後即為1×蛋白上樣緩沖液（還原型）。

2. 抗原樣本制備:

樣品裂解後應立即進行後續免疫沈澱或免疫共沈澱實驗，如果不能立即進行，可以將樣品保存於-20℃或-80℃冰箱，但凍融可能會影響蛋白與蛋白的相互作用；所有的樣品裂解步驟應冰浴或4℃操作，以盡量降低蛋白降解的可能性，樣品準備好之後取一定量作為Input或Total，以用於後續Western Blot等檢測；

對於組織樣品：

a) 取適量組織用預冷PBS（推薦G4202）洗滌，去除血汙，剪成細小碎塊置於勻漿器中；

b) 按照每10-20 mg組織使用100-200 μL的比例加入含蛋白酶抑制劑的IP裂解液，如果需要更高濃度的蛋白樣品，可以適量減少IP裂解液的用量；

c) 用玻璃勻漿器或手持式勻漿機進行勻漿，或者使用本公司自主研發的KZ-III-F低溫型研磨儀進行充分研磨；

d) 將勻漿液轉移至1.5 mL離心管中，振蕩混勻，冰浴30 min，期間每10 min用移液器反覆吹打，確保組織細胞完全裂解；

e) 12000 g 4℃離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液，可進行後續免疫沈澱或免疫共沈澱實驗等；

對於貼壁細胞樣品：

a) 如有必要，可用PBS清洗細胞2-3次，最後一次徹底吸幹殘留液；

b) 用細胞刮刀將細胞刮下或胰蛋白酶消化細胞使其充分懸浮，收集到1.5 mL離心管中1000 g 4℃離心5 min，棄上清即為細胞沈澱；

c) 按照每50-100萬細胞（相當於6孔板的一個孔）加入100-200 μL含蛋白酶抑制劑的IP裂解液；輕彈管底或適當吹打，冰浴3-5 min，以充分裂解細胞，充分裂解後應沒有明顯的細胞沈澱；如果細胞量較多，建議分裝成50-100萬細胞/管，然後再裂解，以達到充分裂解的目的；

d) 充分裂解後，12000 g 4℃離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液，可進行後續免疫沈澱或免疫共沈澱實驗等；

對於懸浮細胞樣品：

a) 1000 g 4℃離心5 min收集細胞沈澱；如有必要，可以用PBS洗滌一次，然後吸凈殘留的液體，輕輕渦旋或彈擊管底以使細胞盡量分散開；

b) 按照每50-100萬細胞加入100-200 μL的比例加入含蛋白酶抑制劑的IP裂解液，輕輕吹打以充分分散細胞；如果細胞量較多，建議分裝成50-100萬細胞/管，然後再裂解，以達到充分裂解的目的；

c) 冰浴5 min，12000 g 4℃離心5 min，取上清，即為總蛋白溶液，可進行後續免疫沈澱或免疫共沈澱實驗等；

對於細菌或酵母樣本：

a) 取1 mL菌液或酵母液，離心去上清，如有必有，可以使用PBS洗滌一次，然後吸凈殘留的液體，輕輕渦旋或者彈擊管底以使細菌或酵母盡量分散開；

b) 加入100-200 μL含蛋白酶抑制劑的IP裂解液，輕輕吹打以充分分散細菌或真菌

c) 冰浴10 min，如果希望獲得更好的裂解效果，細菌和酵母可以分別使用溶菌酶和破壁酶（自備）消化，然後再使用含蛋白酶抑制劑的IP裂解液進行裂解；

d) 12000 g 4℃離心5 min，取上清，即為總蛋白溶液，可進行後續免疫沈澱或免疫共沈澱實驗等；

3. 瓊脂糖凝膠準備：

a) 輕輕重懸SweAgarose Protein A凝膠，盡量形成均勻的凝膠懸濁液，按照通常每500 μL樣本中加入20 μL混合均勻的凝膠懸濁液，取適量凝膠懸濁液於一潔凈EP管中，加入1×TBS至終體積為0.5 mL (以下免疫沈澱步驟中都以每個樣品加入20 μL凝膠懸濁液為例)；

b) 輕輕重懸凝膠，6000×g在4℃離心30 s，小心去除上清，不要吸到凝膠，重覆上述步驟兩次；

c) 按照初始的凝膠懸濁液的體積，用1×TBS重懸凝膠；

4. 抗體與SweAgarose Protein A瓊脂糖凝膠的結合

a) 抗體的準備：按照抗體使用說明中推薦的稀釋比例用1×TBS稀釋抗體，配制成抗體工作液；或將抗體配制成終濃度5-50 μg/mL的抗體工作液，置於冰上備用；（可選做：使用抗體種屬相同的正常IgG配制相同稀釋比或終濃度5-50 μg/mL的正常IgG工作液，去除非特異性結合或作為陰性對照；所謂種屬相同的正常IgG是指如果後續免疫沈澱時用的抗體是小鼠IgG，則在本步驟中可以用1×TBS稀釋適量的正常小鼠IgG以用於降低背景或作為陰性對照）；

b) 抗體吸附：將步驟3中準備好的SweMagrose Protein A瓊脂糖凝膠進行離心分離，6000×g在4℃離心30 s，吸除上清，加入500 μL抗體工作液或正常IgG工作液，重懸後在室溫翻轉混勻儀上孵育15-60 min；

註：也可以直接在步驟3準備好的SweAgarose Protein A瓊脂糖凝膠中加入適量抗體或正常IgG進行孵育；

c) 凝膠分離及洗滌：孵育完成的凝膠進行離心分離，6000×g在4℃離心30s，吸除上清，加入500 μL的1×TBS，用移液器輕輕吹打重懸SweAgarose Protein A瓊脂糖凝膠，6000×g在4℃離心30 s，去除上清，重覆洗滌三次，按照初始體積的量，用1×TBS重懸凝膠；

註：孵育和洗滌過程中，如果凝膠發生團聚或呈片狀屬正常現象，不會影響實驗結果；

5. 免疫沈澱（IP）：

a) 去除非特異性結合（可選做）：步驟4中準備的結合了正常IgG的SweAgarose Protein A瓊脂糖凝膠與樣品4℃孵育60 min後6000×g在4℃離心30 s，上清樣品用於後續實驗；本實驗步驟的目的是去除與正常IgG產生非特異性結合的蛋白；

b) 樣品與結合了抗體或正常IgG的SweAgarose Protein A瓊脂糖凝膠孵育：按照每500 μL蛋白樣品加入20 μL凝膠懸濁液的比例加入結合了抗體或正常IgG的SweAgarose Protein A瓊脂糖凝膠，置於側擺搖床或旋轉混合儀上，室溫孵育2小時或4ºC孵育過夜；

註1：孵育過程中，如果凝膠發生團聚或呈片狀屬正常現象，不會影響實驗結果；

註2：也可先將適量抗體或正常IgG與樣品室溫孵育1-2小時或4℃孵育過夜後，再加入10-20 μL凝膠懸浮液室溫孵育60 min。

c) 離心分離：孵育完畢後，6000×g在4℃離心30 s，去除上清；

註：可保留部分上清液，用於檢測免疫沈澱的效果；

d) 洗滌：加入500 μL的1×TBS，用移液器輕輕吹打重懸凝膠，6000×g在4℃離心30 s，去除上清，重覆洗滌三次；

註：也可以通過檢測洗滌得到的洗滌液的OD280來判斷是否洗滌完全，若OD280大於0.05，應適當增加洗滌次數；

6. 洗脫：

根據目的蛋白的特點及後續實驗要求，可以選擇如下方法之一進行洗脫；

a) 變性洗脫法：此法洗脫的樣品適用於 SDS-PAGE檢測，離心去上清後，向其中加入25 µL 1×蛋白上樣緩沖液（還原型）混合均勻，95℃加熱5 min，然後執行離心分離收集上清液即可進行Western blot檢測；

b) 酸性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用於後期功能分析，離心去上清後，向其中加入20 µL Acid Elution Buffer混合均勻，室溫孵育10 min，然後執行離心分離，收集上清液至新的EP管，並立即加入2 µL Neulization Elution Buffer將洗脫產物pH調節至中性，用於後期功能分析；

注意：用戶可根據實際想獲得體積調整洗脫緩沖液的加入量。

注意事項

1. 試劑盒中組分SweAgarose Protein A請勿保存於-20℃或反覆凍融，否則會影響凝膠的性能，造成不必要的實驗誤差。

2. 在進行免疫沈澱操作之前，請務必認真閱讀本操作說明書。

3. 如果免疫沈澱的目的蛋白涉及磷酸化修飾或者乙酰化修飾，需要自備相應的磷酸酶抑制劑和去乙酰化酶抑制劑。

4. 凝膠需維持pH為6-8，避免高速離心、幹燥或凍存，否則可能會引起凝膠聚團。

5. 凝膠使用前要充分混勻，混勻操作須輕柔，不宜劇烈渦旋震蕩等，避免抗體變性等。

6. 在免疫沈澱時，建議設置陽性和陰性對照組（SweAgarose Mouse IgG）。

7. 蛋白樣品收集後應盡快完成純化工作，並始終放置在4℃或冰浴，以減緩蛋白降解或變性。

8. 酸性溶液洗脫時凝膠可能會發生聚集，屬於正常現象，不影響凝膠的正常使用。

9. 本產品僅限於專業人員的科學研究用，不得用於臨床診斷或治療，不得用於食品或藥品，不得存放於普通住宅內。

10. 為了您的安全與健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

11. Protein A、Protein G對不同種屬來源及亞型抗體結合能力見附表一。