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RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統的細胞及組織快速裂解液。RIPA裂解液有很多配方,按其裂解效果Servicebio 主要分為強效型、溫和型兩種。RIPA溫和型裂解液裂解組織、細胞得到的蛋白樣品可以用於常規的PAGE、Western等對蛋白活性沒有嚴格要求的實驗。本產品主要成分為:50 mM Tris-HCl (pH 7.4),150 mM NaCl,1 mM EDTA-2Na2,0.25% Sodium deoxycholate,和1% NP-40。本產品適用於動物或植物組織及細胞樣品,也可用於真菌或細菌樣品。
實驗步驟
前處裡注意事項: RIPA裂解液(溫和型)在臨用前需加入蛋白酶抑制劑,推薦G2006,G2007,G2008等,防止蛋白降解。以下使用方法中提到的RIPA裂解液(溫和型)均指已添加蛋白酶抑制劑。
對於組織樣品:
1. 組織塊用預冷PBS(推薦G4202)洗滌,去除血汙,剪成細小碎塊置於勻漿器中。
2. 加入10倍組織體積RIPA裂解液(溫和型)低溫研磨(推薦Servicebio自主研發生產的高速組織研磨儀KZ-III-F及KZ-III-FP)。注意: RIPA裂解液(溫和型)的使用量可按照約每50 mg組織與1 mL裂解液的比例添加。如組織蛋白含量較低,可降低裂解液的用量,以提高粗提溶液中的蛋白濃度。
3. 將組織研磨液轉移至1.5 mL離心管中,振蕩。冰浴30 min,期間每10 min用移液器反覆混勻,確保組織細胞完全裂解。
4. 12000 g離心5 min,收集上清,即為總蛋白溶液。
對於貼壁細胞樣品:
1. 用PBS清洗細胞2-3次,最後一次徹底吸乾殘留液。
2. 按照6孔板每孔細胞250 μL裂解液的比例吸取RIPA裂解液(溫和型)於細胞培養板、瓶內,反覆晃動培養板、瓶,使裂解液與細胞充分接觸3-5 min。
3. 用細胞刮刀將細胞刮下,收集到離心管中。
4. 冰上裂解30 min。
5. 12000 g離心5 min,收集上清,即為總蛋白溶液。
對於懸浮細胞樣品:
1. 離心收集細胞。
2. 按照6孔板每孔細胞250 μL裂解液的比例將細胞液與RIPA裂解液(溫和型)混合,振蕩。
3. 冰浴30 min,期間每10 min用移液器反覆吹打數次,確保細胞完全裂解。
4. 12000 g離心5 min,收集上清,即為總蛋白溶液。
對於細菌或真菌樣本:
1.取1 mL菌懸液,離心去上清,PBS洗滌一次,充分去除液體。vortex 使菌體盡量分散。
2.加入100-200 μL RIPA裂解液(溫和型),輕輕vortex使菌體與裂解液充分混勻。
3.冰浴10 min,期間每2 min用移液器反覆混勻數次,確保菌體完全裂解。
4.12,000 g離心5 min,收集上清,即為總蛋白溶液。
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