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TSAPLus 多重螢光染色試劑組 (6標7色)
商品編號：G1257-50T
本產品TSAPLus 多重螢光染色試劑組 (6標7色)，適用於石蠟切片、冰凍切片、組織漂片、細胞爬片、細胞塗片、類器官等組織樣本的免疫螢光多重染色，特別適用於相同來源一抗的多重螢光免疫標記，也可用於不同來源抗體的多重螢光免疫標記。主要原理是基於酪胺訊號放大（TSA， Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術。 TSA技術主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應（即螢光標記的酪胺鹽在HRP催化H 2 O 2下形成共價鍵結合位點），產生大量的酶促反應，該產物能與周圍的蛋白殘基（包括色氨酸、組氨酸、酪氨酸殘基） 594/647/700對酪胺標記穩定，用於重複螢光，應用螢光，多次高，且對螢光疫苗也得到重複的螢光標記。
TSA 系列螢光染色試劑盒相關螢光染料的螢光光譜數據如下：
| 螢光染料類型 | 激發波長/nm | 發射波長/nm |
| DAPI | 359 | 457 |
| iF440-Tyramide | 434 | 480 |
| iF488-Tyramide | 491 | 516 |
| iF546-Tyramide | 541 | 557 |
| iF555-Tyramide | 557 | 570 |
| iF594-Tyramide | 588 | 604 |
| iF647-Tyramide | 656 | 670 |
| iF700-Tyramide | 690 | 713 |
| iF750-Tyramide | 757 | 779 |
實驗前準備：
1. 自備抗原修復液（建議G1201 ， G1202 ， G1209等），Tris- EDTA抗原修復液（pH 8.0）（建議G1206 ，G1207 101207 ），Tris50 G1218）；
2. 自備PBS磷酸鹽緩衝液（建議G4202 或G0002）；
3. 自備TBST緩衝液（建議G0004）;
4. 自備3% H 2 O 2和0.3% H 2 O 2；
5. 自備各種封閉用血清（依抗體類型選擇適當的封閉血清，推薦牛血清白蛋白BSA GC305010或GC305006，正常驢血清G1217，正常兔血清G1209，正常山羊血清G1208）；
6. 自備所需一抗；
7. 自備對應HRP標記二抗（建議GB23204；GB23301；GB23302；GB23303；GB23404）；
8. 每輪抗體標記完成後，需要進行抗體洗脫，除了常規的高溫加熱洗脫以外，強烈建議本公司的免疫染色抗體洗脫液（G1266），用此抗體洗脫液洗脫法相比高溫加熱洗脫法更溫和，可避免多次加熱對組織形態結構造成損傷破壞，同時能將一抗二抗徹底洗脫去除。
9. 依劑量，依下表比例配製TSA染色工作液。
9. 依劑量，依下表比例配製TSA染色工作液。
| TSA 染色工作液 | 試劑名稱 | 體積 |
| iF440-TSA染色工作液 | Tyramide稀釋液 | 1 mL |
| 0.3% H 2 O 2 | 10 μL | |
| iF440-Tyramide | 2 μL | |
| iF488-TSA染色工作液 | Tyramide稀釋液 | 1 mL |
| 0.3% H 2 O 2 | 10 μL | |
| iF488-Tyramide | 2 μL | |
| iF546-TSA染色工作液 | Tyramide稀釋液 | 1 mL |
| 0.3% H 2 O 2 | 10 μL | |
| iF546-Tyramide | 2 μL | |
| iF594-TSA染色工作液 | Tyramide稀釋液 | 1 mL |
| 0.3% H 2 O 2 | 10 μL | |
| iF594-Tyramide | 2 μL | |
| iF647-TSA染色工作液 | Tyramide稀釋液 | 1 mL |
| 0.3% H 2 O 2 | 10 μL | |
| iF647-Tyramide | 2 μL | |
| iF750-TSA染色工作液 | Tyramide稀釋液 | 1 mL |
| 0.3% H 2 O 2 | 10 μL | |
| iF750-Tyramide | 2 μL |
實驗步驟
以石蠟組織切片為例，以下實驗步驟的實驗用水均為純水：
1．石蠟切片脫蠟至水：依序將切片放入環保型脫蠟液（G1128）I 10 min-環保脫蠟液（G1128）II 10 min-環保脫蠟液（G1128）III 10 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅲ5 5 min-min-min 5 min-無水蒸餾。
2．抗原修復：依組織類型及抗體種類，選擇對應的抗原修復液( G1219 , pH 6.0；G1207 , pH 8.0；G1218 , pH 9.0)及修復方式進行抗原修復。一般修復方式為抗原修復儀（賽維爾即將上市產品），微波，高壓等高溫修復。此過程中應防止修復液過度蒸發，切勿乾片。自然冷卻後將玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。
3．畫圈,雙氧水封閉：切片稍甩乾後用組化筆（G6100）沿著組織周圍畫圈，一般距離組織3 mm左右，畫完圈待圈乾後用純水（G4701 ）或PBS（G2156）潤洗一遍，之後將切片放入3%雙氧水溶液中，室溫避光封閉完成後將玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。
4．血清封閉: 切片稍微甩乾後，向組織上滴加3%BSA或血清室溫封閉30 min ，具體依一抗及二抗種屬決定封閉試劑。
5．加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放於濕盒內（SIB-20F），4°C孵育過夜。 （濕盒底部加少量水防止抗體蒸發）
6．加對應的HRP標記的二抗體：玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min。
7．加iF 440 -TSA：載玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加配製好的iF440- TSA （G1231）工作液，避光室溫孵育10 min 。孵育完後，將玻片置於TBST （G2150）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min 。
8．抗體洗脫：
8.1微波處理：將組織切片置於盛滿抗原修復液（依組織類型及抗體選擇適當的抗原修復液）的修復盒中進行微波加熱處理，去除已結合的一抗二抗。 （加熱的溫度和時間建議：加熱至95℃以上，維持15分鐘。）此過程中應防止緩衝液過度蒸發，切勿乾片。自然冷卻後將玻片置於PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；
8.2免疫染色抗體洗脫液（G1266）處理（強烈建議）：切片稍甩乾後將恢復至室溫的抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min後去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完全覆蓋組織，37°C孵育30 min，孵育完成後將搖床放置在時間後將搖床（BSYC 10116-2013133303333533353 3353年（CSY））上晃動洗滌3次，每次5 min。
9．血清封閉: 切片稍微甩乾後，向組織上滴加3%BSA或血清室溫封閉30 min ，具體依一抗及二抗種屬決定封閉試劑。
10．加第二種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放於濕盒內（SIB-20F），4°C孵育過夜。 （濕盒底部加少量水防止抗體蒸發）
11．加對應的HRP標記的二抗體：玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min。
12．加iF 488 -TSA：載玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加配製好的iF488- TSA （G1231）工作液，避光室溫孵育10 min 。孵育完後，將玻片置於TBST （G2150）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min 。
13．抗體洗脫：
13.1微波處理：將組織切片置於盛滿抗原修復液（依組織類型及抗體選擇適當的抗原修復液）的修復盒中進行微波加熱處理，去除已結合的一抗二抗。 （加熱的溫度和時間建議：加熱至95℃以上，維持15分鐘。）此過程中應防止緩衝液過度蒸發，切勿乾片。自然冷卻後將玻片置於PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；
13.2免疫染色抗體洗脫液（G1266）處理（強烈建議）：切片稍甩乾後將恢復至室溫的抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min後去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完全覆蓋組織，37°C孵育
30 min，孵育完成後將玻片置於TBST（G2150）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。
14．血清封閉: 切片稍微甩乾後，向組織上滴加3%BSA或血清室溫封閉30 min ，具體依一抗及二抗種屬決定封閉試劑。
15．加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放於濕盒內（SIB-20F），4°C孵育過夜。 （濕盒底部加少量水防止抗體蒸發）
16．加對應的HRP標記的二抗體：玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min。
17．加iF 546 -TSA：載玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加配製好的iF546- TSA （G1231）工作液，避光室溫孵育10 min 。孵育完後，將玻片置於TBST （G2150）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min 。
18．抗體洗脫：
18.1微波處理：將組織切片置於盛滿抗原修復液（依組織類型及抗體選擇適當的抗原修復液）的修復盒中進行微波加熱處理，去除已結合的一抗二抗。 （加熱的溫度和時間建議：加熱至95℃以上，維持15分鐘。）此過程中應防止緩衝液過度蒸發，切勿乾片。自然冷卻後將玻片置於PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；
18.2免疫染色抗體洗脫液（G1266）處理（強烈建議）：切片稍甩乾後將恢復至室溫的抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min後去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完全覆蓋組織，37°C孵育
30 min，孵育完成後將玻片置於TBST（G2150）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。
19．血清封閉: 切片稍微甩乾後，向組織上滴加3%BSA或血清室溫封閉30 min ，具體依一抗及二抗種屬決定封閉試劑。
20．加第四種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放於濕盒內（SIB-20F），4°C孵育過夜。 （濕盒底部加少量水防止抗體蒸發）
21．加對應的HRP標記的二抗體：玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min。
22．加iF 594 -TSA：載玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加配製好的iF594- TSA （G1231）工作液，避光室溫孵育10 min 。孵育完後，將玻片置於TBST （G2150）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min 。
23．抗體洗脫：
23.1微波處理：將組織切片置於盛滿抗原修復液（依組織類型及抗體選擇適當的抗原修復液）的修復盒中進行微波加熱處理，去除已結合的一抗二抗。 （加熱的溫度和時間建議：加熱至95℃以上，維持15分鐘。）此過程中應防止緩衝液過度蒸發，切勿乾片。自然冷卻後將玻片置於PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；
23.2免疫染色抗體洗脫液（G1266）處理（強烈建議）：切片稍甩乾後將恢復至室溫的抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min後去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完全覆蓋組織，37°C孵育
30 min，孵育完成後將玻片置於TBST（G2150）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。
24．血清封閉: 切片稍微甩乾後，向組織上滴加3%BSA或血清室溫封閉30 min ，具體依一抗及二抗種屬決定封閉試劑。
25．加第五種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放於濕盒內（SIB-20F），4°C孵育過夜。 （濕盒底部加少量水防止抗體蒸發）
26．加對應的HRP標記的二抗體：玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min。
27．加iF 647 -TSA：載玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加配製好的iF647- TSA （G1231）工作液，避光室溫孵育10 min 。孵育完後，將玻片置於TBST （G2150）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min 。
28．抗體洗脫：
28.1微波處理：將組織切片置於盛滿抗原修復液（依組織類型及抗體選擇適當的抗原修復液）的修復盒中進行微波加熱處理，去除已結合的一抗二抗。 （加熱的溫度和時間建議：加熱至95℃以上，維持15分鐘。）此過程中應防止緩衝液過度蒸發，切勿乾片。自然冷卻後將玻片置於PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；
28.2免疫染色抗體洗脫液（G1266）處理（強烈建議）：切片稍甩乾後將恢復至室溫的抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min後去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完全覆蓋組織，37°C孵育
30 min，孵育完成後將玻片置於TBST（G2150）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。
29．血清封閉: 切片稍微甩乾後，向組織上滴加3%BSA或血清室溫封閉30 min ，具體依一抗及二抗種屬決定封閉試劑。
30．加第六種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放於濕盒內（SIB-20F），4°C孵育過夜。 （濕盒底部加少量水防止抗體蒸發）
31．加對應的HRP標記的二抗體：玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min。
32．加iF 750 -TSA：載玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後在圈內滴加配製好的iF750- TSA （G1231）工作液，避光室溫孵育10 min 。孵育完後，將玻片置於TBST （G2150）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min 。
33．DAPI複染細胞核：切片稍甩乾後在圈內滴加DAPI染液（G1012），避光室溫孵育10 min。
34．自發螢光淬滅：玻片置於PBS（G2156）中在鐘擺搖床（SYC-Z100）上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩乾後，在圈內加入組織自發螢光淬滅劑（G1221-2）避光孵育5 min，流水沖洗10 min。
35．封片：切片稍甩乾後用抗螢光淬滅封片劑（G1401）封片。
36．鏡檢拍照：切片於螢光顯微鏡下觀察並擷取影像，也可用螢光掃描儀掃描成像。切片置於避光切片盒內4℃可保存15天。
注意事項
1. 與螢光二抗體相比，TSA試劑盒有更高的靈敏度和更強的訊號。因此一抗使用濃度需降低，一般在抗體說明書建議的稀釋比基礎上再擴大5-10倍，以減少非特異性結合所導致的背景螢光。建議設定一抗梯度濃度以獲得最佳效果。
2. 如背景螢光較強，建議增加組織自發螢光淬滅步驟。
3. 螢光Tyramide的建議稀釋比是1:500，可依實驗結果調整稀釋比例（調整範圍1:200 - 1:1000）。
4. 為確保抗體洗脫效果及螢光多重標記效果，正式多重標記之前需分別做各個抗體的TSA單標測試（即一抗—HRP二抗—對應多標中的TSA），確定每個抗體單標都能做出較理想的陽性後再根據單標測試結果去確定多標的抗原修復條件，抗體順序等實驗條件。
5. 如果有些抗體效價高，親和力較強，不易洗脫徹底，可提高洗滌溫度至50℃ 30 min，或增加洗脫次數，即組織上加入抗體洗脫液 37℃孵育 30 min後，去除抗體洗脫液，再加入新的抗體洗脫液，繼續 37℃孵育 30 min 。
6. 此抗體洗脫液流動性強，片子未水平放置時，試劑易流出圈外，影響洗脫效果，需在操作過程注意切片平放。
7. 操時需帶手套，口罩，穿著實驗服，避免試劑接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸到敏感區域，立即以大量清水沖洗。
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