Servicebio 2×Multiplex Probe qPCR Master Mix with UDG（None ROX）是基於探針法的2×熒光定量PCR預混液（None ROX），包含有熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP和所必須的緩沖成分，可在同一反應管中同時進行多達四重的熒光定量PCR反應。預混液中不含校正染料，適用於無需ROX校正的設備。本產品添加藍色非熒光染料，可避免加樣錯誤，另外本產品中還包含有Uracil-DNA Glycosylase（UDG）以及專門優化的dUTP添加量，可防止模板殘留汙染，提高產品的特異性、靈敏度與精確性。
操作步驟
1. 推薦PCR反應體系
|
Component |
20 μL rxn |
Final Concentration |
|
2×Multiplex Probe qPCR Master Mix with UDG（None ROX） |
10 μL |
1× |
|
Forward Primer（10 μM）a |
Variable |
0.1-0.5 μM |
|
Reverse Primer（10 μM）a |
Variable |
0.1-0.5 μM |
|
Probe（10 μM）a |
Variable |
0.1-0.5 μM |
|
Templateb |
Variable |
as required |
|
Nuclease-free Water |
Add to 20 μL |
a.通常引物和探針終濃度為0.2 μM可以得到較好結果。反應性能較差時，可以在0.1-0.5 μM範圍內調整引物濃度。
b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷貝數不同而不同，進行梯度稀釋研討適當的模板添加量。在20 μL反應體系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反應的cDNA（RT反應液）為模板時，添加量不要超過PCR反應液總體積的10%。
2. PCR反應程序（可根據機型適當調整）
|
A. Two-step method |
B. Three-step method |
||||||||
|
Stage |
Step |
Cycle |
Temp |
Time |
Stage |
Step |
Cycle |
Temp |
Time |
|
Stage 1 |
UDG incubation |
1 |
50°C |
2 min |
Stage 1 |
UDG incubation |
1 |
50°C |
2 min |
|
Stage 2 |
Pre- denaturation |
1 |
95°C |
30 sec |
Stage 2 |
Pre- denaturation |
1 |
95°C |
30 sec |
|
Stage 3 |
Denaturation |
40 |
95°C |
15 sec |
Stage 3 |
Denaturation |
40 |
95°C |
15 sec |
|
Annealing /Extension |
60°C |
30 seca |
Annealing |
55-65°C |
10 sec |
||||
|
Extension |
72°C |
30 seca |
|||||||
a.需提高擴增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；需提高擴增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。
注意事項
1. 預混液解凍後請輕輕地上下顛倒混勻，勿渦旋振蕩混勻，避免產生氣泡，混勻後再使用。
2. 配制反應液時，試劑請於冰上放置。
3. 本制品中含有熒光染料，配制qPCR反應液時應避免強光照射。
4. 反應液的配制、分裝請使用新的一次性吸頭、盡量避免樣品間的汙染。
5. 避免反覆凍融，解凍後盡量在一個月內使用完畢。
適配機型
ABI：PikoRealTM Cycler;
Bio-Rad：CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;
Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;
IIIumina：Eco QPCR;
Cepheid：SmartCycler®;
Qiagen Corbett：Rotor-Gene®系列;
Roche：LightCycler™系列;
Takara：Thermal Cycler Dice系列;
Analytikjena：qTOWER系列;
杭州博日：LineGene系列。
