Servicebio 2 × SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX)是使用SYBR Green I嵌合熒光法進行qPCR反應的專用2×預混液，包含除引物、DNA模板以外的所有qPCR組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低汙染幾率。核心組分為基因工程改造後的熱啟動Taq DNA Polymerase，通過單克隆抗體與Taq DNA Polymerase高效結合，有效地封閉DNA聚合酶活性，阻止低溫下的非特異性擴增，具有特異性強、檢測靈敏度高等諸多優點，配以針對qPCR優化的反應Buffer，非常適合於進行高特異性、高靈敏度的qPCR反應。本產品是一種含有qPCR反應最適濃度SYBR Green I的2×預混試劑，可以在寬廣的定量區域內得到良好的標準曲線，對靶基因定量準確、重覆性好、可信度高。
操作步驟
1. 推薦PCR反應體系
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Component |
20 μL rxn |
50 μL rxn |
Final Concentration |
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2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
10 μL |
25 μL |
1× |
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Forward Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
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Reverse Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
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Templateb |
Variable |
Variable |
as required |
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Nuclease-Free Water |
Add to 20 μL |
Add to 50 μL |
a.通常引物終濃度為0.2 μM可以得到較好結果。反應性能較差時，可以在0.2-1.0 μM範圍內調整引物濃度。
b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷貝數不同而不同，進行梯度稀釋研討適當的模板添加量。在20 μL反應體系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反應的cDNA（RT 反應液）為模板時，添加量不要超過PCR反應液總體積的10%.
2.PCR反應程序（可根據機型適當調整）
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Stage |
Step |
Number of Cycles |
Temperature |
Time |
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Stage 1 |
Predegeneration |
1 |
95℃ |
30 seca |
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Stage 2 |
Degeneration |
40 |
95℃ |
3-10 secb |
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annealing-extension |
60℃ |
10-30 secc |
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Stage 3 |
melting curve |
1 |
Instrument default Settings |
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*需提高擴增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；需提高擴增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。
a. 熒光信號采集請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置。
注意事項
1. 使用前請上下輕輕顛倒混勻，請勿渦旋振蕩混勻，避免產生氣泡，試劑混勻後再使用。
2. 配制反應液時，試劑請於冰上放置。
3. 本制品中含有熒光染料SYBR Green，配制PCR反應液時應避免強光照射。
4. 反應液的配制、分裝請使用新的一次性槍頭、盡量避免樣品間的汙染。
5. 避免反覆凍融Master Mix，解凍後盡量在一個月內使用完畢。
