Servicebio 2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (with UDG)是使用SYBR Green I嵌合熒光法進行qPCR反應的專用2×預混液。使用抗體法封閉的Taq DNA Polymerase再結合UDG（Uracil-DNA Glycosylase）和dUTP，一方面能有效降低引物二聚體的形成，增強特異性，提高靈敏度，另一方面可防止PCR擴增產物引起的交叉汙染，對靶基因定量更加準確。同時本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye以及藍色可視化加樣示蹤染料，可適用於所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調整ROX濃度。同時配套提供黃色模板稀釋液，當用黃色模板稀釋液稀釋模板，並將其加入到藍色反應預混液中，顏色由藍色變為綠色，能夠對配制反應體系過程起到示蹤作用，防止漏加或錯加。該藍色與黃色染料的光譜與qPCR染料不重疊，不影響反應結果。
內容物
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Component Number |
Component |
G3328-01 |
G3328-05 |
G3328-15 |
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G3328-1 |
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (with UDG) |
1 mL |
5×1 mL |
15×1 mL |
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G3328-2 |
40×Yellow Template Dilution Buffer |
1 mL |
1 mL |
1 mL |
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Manual |
1 copy |
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實驗步驟
1. （可選）模板稀釋
本試劑盒中提供40×Yellow Template Dilution Buffer，是40倍濃縮的黃色模板稀釋液，用於DNA模板稀釋，可通過液體顏色變化準確判斷模板是否已經加入到qPCR反應液中。以20 μL qPCR反應體系為例，根據加入到20 μL qPCR反應液中稀釋後的模板量，對應原始模板稀釋方法可參考下表（以原始模板稀釋至100 μL為例）：
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Add the diluted template to the 20 μL qPCR reaction solution (μL) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
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Add the 40x YELLOW Template Dilution Buffer to the 100 μL Template Dilution System (μL) |
50 |
25 |
16.7 |
12.5 |
10 |
8.4 |
7.2 |
6.3 |
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Add the 100μL Template Dilution System to the primary template (μL) |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
x |
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Volume of adding Nuclease - Free Water (μL) |
50-x |
75-x |
83.3-x |
87.5-x |
90-x |
91.6-x |
92.8-x |
93.7-x |
注意：如模板濃度過低無需稀釋，或不想使用G3328-2的模板稀釋液，可忽略此步驟。
2. 推薦qPCR反應體系：
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Component |
20 μL rxn |
50 μL rxn |
Final Concentration |
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2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (with UDG) |
10 μL |
25 μL |
1× |
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Forward Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
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Reverse Primer (10 μM)a |
0.4 μL |
1 μL |
0.2 μM |
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Templateb |
Variable |
Variable |
as required |
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Nuclease-free Water |
Add to 20 μL |
Add to 50 μL |
a.通常引物終濃度為0.2 μM可以得到較好擴增效果。反應性能較差時，可以在0.2-1.0 μM範圍內調整引物濃度。
b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷貝數不同而不同，進行梯度稀釋研討適當的模板添加量。在20 μL反應體系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反應的cDNA（RT反應液）為模板時，添加量不要超過PCR反應液總體積的10%。
3. PCR反應程序（可根據機型適當調整）：
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A. Two-step method |
B. The three-step method |
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stage |
step |
Cycle number |
Temp erature |
time |
stage |
step |
Cycle number |
Temp erature |
time |
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Stage 1 |
UDG incubation |
1 |
50℃ |
2 min |
Stage 1 |
UDG incubation |
1 |
50℃ |
2 min |
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Stage 2 |
predegeneration |
1 |
95℃ |
30 sec |
Stage 2 |
Predeg eneration |
1 |
95℃ |
30 sec |
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Stage 3 |
denaturation |
40 |
95℃ |
15 sec |
Stage 3 |
denaturation |
40 |
95℃ |
15 sec |
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Annealing /extension |
60℃ |
30 seca |
Annealing |
55-65℃ |
10 sec |
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Extension |
72℃ |
30 seca |
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Stage 4 |
Melting curve |
1 |
Instrument default setting |
Stage 4 |
Melting curve |
1 |
Instrument default setting |
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a.若需提高擴增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；若需提高擴增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。
注意事項
1. 如不需要進行移液追蹤，則不使用40×Yellow Template Dilution Buffer進行模板稀釋。
2. 試劑使用前請上下輕輕顛倒混勻，請勿渦旋振蕩混勻，避免產生氣泡。
3. 配制反應液時，試劑請於冰上放置。
4. 本制品中含有熒光染料SYBR Green，配制PCR反應液時應避免強光照射。
5. 反應液的配制、分裝請使用新的一次性槍頭，盡量避免樣品間的交叉汙染。
6. 避免反覆凍融Master Mix，解凍後後盡量在一個月內使用完畢。
適配機型
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler;
Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;
Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;
Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;
IIIumina: Eco QPCR;
Cepheid: SmartCycler®;
Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列;
Roche: LightCycler™ 系列;
Takara: Thermal Cycler Dice系列;
Analytikjena: qTOWER系列;
杭州博日: LineGene系列。
引物設計原則
1. 擴增產物長度建議控制在80-300 bp之間；
2. 引物長度：18-25 bp；
3. 引物中堿基G＋C含量應在40%-60%之間；
4. 正向引物和反向引物的Tm值相差不超過2℃為佳，Tm值控制在58-62℃為佳；
5. 堿基分布的隨機性；
6. 引物最好不要含有自身互補序列，否則會形成發夾二級結構；
7. 兩個引物之間不應有多於4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3'端的互補重疊；
8. 建議引物的3'末端堿基為G或C；
9. NCBI上的比對結果無其他非特異性產物出現。
