Servicebio Plant Tissue Direct PCR Kit是一款專為不同類型植物組織直接進行PCR所設計的產品，無需基因組DNA提取，只需簡單處理可直接作為PCR擴增的模板，對於普通植物樣本及多糖多酚植物樣本均可兼容。
本試劑盒提供的2×Plant Direct PCR Master Mix專門針對植物組織樣本直接擴增進行了優化，大大提高了擴增效率及抗抑制劑效果。此外，該試劑包含了PCR擴增除模板和引物外的所有組分，並添加了Loading Dye，擴增產物可直接點樣電泳，大大簡化了操作過程。該產品的簡便性和強兼容性可用於快速轉基因植株鑒定、植物基因分型等分子生物學實驗。
內容物
|
Component Number |
Component |
G3313-01 |
|
G3313-1 |
2×Plant Direct PCR Master Mix |
1 mL |
|
G3313-2 |
Lysis Buffer A |
5 mL |
|
G3313-3 |
Lysis Buffer B |
4 mL |
|
G3313-4 |
Direct PCR Enhancer |
500 μL |
|
G3313-5 |
Nuclease-free Water |
5 mL |
實驗步驟
1. 植物組織裂解後擴增
1）取5 mm2左右的植物葉片（推薦使用新鮮幼嫩的植物葉片）或5 mg的種子（對於堅硬種子可先用研磨儀或研缽研磨成粉末狀）於Nuclease-free離心管中，加入50 μL Lysis Buffer A，用槍頭或其他方式將植物樣本搗碎（如：煙草葉片搗碎後溶液變為綠色；研磨成粉末的種子樣本用槍頭攪拌均勻），於室溫下靜置5 min。
2）加入40 μL Lysis Buffer B，渦旋振蕩或吹打混勻後離心，將沈澱收集到管底，取上清，用Nuclease-free Water稀釋5倍後作為模板備用。
3）推薦PCR反應體系：
|
Component |
20 μL rxn |
Final Concentration |
|
2×Plant Direct PCR Master Mix |
10 μL |
1× |
|
Forward Primer (10 μM)a |
0.8 μL |
0.4 μM |
|
Reverse Primer (10 μM)a |
0.8 μL |
0.4 μM |
|
Templateb |
Variable（≤4 μL） |
|
|
Nuclease-free Water |
Add to 20 μL |
a. 引物終濃度使用範圍0.2~1.0 μM，推薦引物濃度為0.4 μM，過少的引物可能會導致擴增產量低或無擴增，過量的引物可能會導致非特異擴增。
b. 一般20 μL體系中加入2 μL稀釋5倍後的裂解液時可獲得較好的結果，可根據植物樣本裂解的難易程度調整模板加入量，加入量不超過4 μL。
2. 植物葉片直接擴增（推薦PCR反應體系）a：
|
Component |
50 μL rxn |
Final Concentration |
|
2×Plant Direct PCR Master Mix |
25 μL |
1× |
|
Direct PCR Enhancer |
10 μL |
|
|
Forward Primer (10 μM)b |
2 μL |
0.4 μM |
|
Reverse Primer (10 μM)b |
2 μL |
0.4 μM |
|
Templatec |
1 mm2 |
|
|
Nuclease-free Water |
Add to 50 μL |
a. 植物葉片直接擴增僅適用於1 kb以下片段擴增，推薦使用新鮮幼嫩的植物葉片。
b. 引物終濃度使用範圍0.2~1.0 μM，推薦引物濃度為0.4 μM，過少的引物可能會導致擴增產量低或無擴增，過量的引物可能會導致非特異擴增。
c. 推薦50 μL體系中加入的葉片在1 mm2左右，通過打孔器或剪刀將葉片裁剪至1 mm2大小。
3. 推薦PCR擴增條件：
|
Step |
Temperature |
Time |
Cycles |
|
Initial Denaturationa |
98℃ |
2 min~10 min |
1 |
|
Denaturation |
98℃ |
10 sec |
35 |
|
Annealing |
50~65℃ |
30 sec |
|
|
Extensionb |
72℃ |
10~15 sec/kb |
|
|
Final extension |
72℃ |
5~10 min |
1 |
|
Hold |
4~16℃ |
Forever |
a. 植物組織裂解後擴增變性時間可縮短至2 min，植物葉片直接擴增變性時間推薦使用10 min。
b. 常規基因組模板推薦延伸速度10~15 s/kb；覆雜模板15~30 s/kb。
注意事項
1. 操作之前，請務必認真閱讀本產品說明書。
2. 盡量使用新鮮植物葉片，否則會影響擴增效率。
3. 如果采用裂解後擴增，樣本的搗碎程度與擴增效率成正比。
4. 擴增1 kb以下的片段直接取1 mm2葉片作為模板，擴增1~2 kb的片段需裂解後取上清作為模板。
5. 2×Plant Direct PCR Master Mix避免反覆凍融，解凍後盡量在一個月內使用完畢。
6. 反應液的配制、分裝請使用新的一次性無酶吸頭、盡量避免樣品間的汙染。
