一抗與二抗匹配錯誤
檢查是否拿錯抗體，可能物種沒有對應正確                      

ECL失效或不靈敏
重新配置ECL或是改用Femto等級ECL

過度Blocking或 過度清洗
減少Blocking時間或清洗時間，可調整Tween20比例不高於0.1%

一抗濃度偏低或蛋白濃度偏低
請調整抗體，並重新配置；確認目標蛋白在樣本中是的濃度

轉漬時間不充足或過久
可先使用麗春紅染色確認是否有轉漬成功

蛋白降解
確認蛋白提取時的步驟,是否全程低溫；是否有使用蛋白酶抑制劑，以及器具是否乾淨(玻璃/齒梳/Tip/電泳緩衝液)

蛋白降解
確認蛋白提取時的步驟,是否全程低溫；是否有使用蛋白酶抑制劑，以及器具是否乾淨(玻璃/齒梳/Tip/電泳緩衝液)                      

抗體特異性不高
請重新購買抗體

蛋白有聚合體，如二聚體、四聚體和多聚體
蛋白配置時確認是否有經過高溫解聚

未Blocking或Blocking有問題(條件時間、溫度、成分)
重新調整Blocking條件；選擇較適合的Blocking buffer(BSA或市售Blocking buffer)

上樣量過多
適當減少上樣量

蛋白具有多種修飾形式與亞型
查閱文獻或進行生物資訊分析，取得修飾序列的修飾位點訊息，透過去修飾確定修飾修飾的實際大小

轉漬耗材老舊
更換轉漬海綿與濾紙，可能因為鬆動或三明治夾不緊導致                 

ECL覆蓋不均勻
適量增加ECL,確實覆蓋PVDF/NC膜

一抗培養抗體時間過短                                                       
增加一抗培養時間,或4度冰箱延長培養時間                            

ECL反應時間不夠久
增加ECL成色的時間

膠體齒梳槽不平整
加入樣本前用針頭將齒梳槽撥正                     

蛋白樣本總量過大
請減少上樣量,可使用高倍的sample buffer (5X)

上層膠電壓過高或聚集時間過短
電壓過高導致膠體聚集不完全,請降低電壓,或延長時間

樣本裡有不溶性顆粒或雜交污染
製作樣本時要充分離心，實驗所用的器材需潔淨  

Blocking buffer內有不溶性顆粒
重新配置Blocking buffer,必要時可過濾再使用                      

濾膜被汙染
裁切濾膜時,請戴手套,清潔周圍環境

轉漬時膜與膠之間有氣泡
請確實趕走氣泡,或是使用WB專用滾輪                                

一抗與二抗重複使用過多次
盡量不重複使用抗體