一、實驗原理

WB實驗講到了關鍵流程——免疫反應，具體包括清洗抗體、Blocking、一抗培養、清洗PVDF/NC膜、二抗培養後清洗PVDF/NC膜，這個流程是使用“一抗”作為“探針”， 標記的二抗用來“顯色”，以檢測目標蛋白。

二、實驗步驟

1.Blocking時間過長（過度Blocking）可能導致抗原表現位置的遮蔽，降低檢測靈敏度；封閉時間過短（不完全封閉）可能導致背景高，因此需要選擇合適的封閉液，優化封閉的條件。
2.要事先查好每個蛋白的抗體訊息，對於一抗是兔/大小鼠來源的蛋白，用脫脂牛奶（G5002-100G）Blocking即可，Goat來源的則需要專門的Goat blocking buffer（G2010-100ML）。
3.一抗的稀釋比例依抗體說明書配製（例如Blocking buffer 3mL，抗體稀釋比例1:1000，加入3uL 的一抗即可）。
4.二抗配置：二抗的培養時間可依實驗室溫度調整，室溫較高，時間可適當減少，室溫較低，需適當延長二抗孵育時間。

三、抗體選擇小技巧

一抗選擇
1. 了解樣本蛋白的結構資訊。了解待測樣本蛋白的結構域和樣本在萃取和處理過程中是否會變性，蛋白空間構象的改變，會影響抗體的免疫親和反應。
2. 確定實驗樣本的種屬。 Human,Mouse,Rat或其他。一般抗體說明書都會列出此抗體適用的種屬，依照說明書的種屬來選擇適合實驗的抗體。
3. 根據實驗類型選擇對應的抗體。選擇說明書所列的實驗類型含WB的抗體。
4. Monoclonal或Polyclonal抗體的選擇。在抗原抗體反應中，一般單株抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多株抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，易出現非特異性染色，可透過封閉等避免。

二抗選擇
1. 來源物種 主要根據一抗種屬來源來決定購買二抗來源，如一抗是小鼠來源，那二抗選擇抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。
2. 標記物的選擇 做Wstern Blot最常用的二抗體是HRP標記的二抗體。