讓Servicebio成為您的WB實驗小幫手

WB真的是生命科學中研究蛋白質分子傳遞相關的重要實驗，但該注意且不可控的因素真的太多了!

我們上一片文章幫您整理電泳相關注意事項，這篇文章幫您介紹轉漬電泳的注意事項喔!

 

一、實驗介紹

WB轉膜法主要分為半乾法、濕式法。
半乾法：轉膜時間短，速度快，所需緩衝液少，乾燥條件下轉漬容易失敗；
濕式法：是比較常用的轉漬方法，不會因為膜的乾燥而失敗，更穩定。

二、實驗步驟

此步驟是Western Blot最終結果影響最大的一步，轉膜的好壞直接決定了實驗結果。

常用的膜主要有PVDF膜和NC膜（纖維纖維素膜）。

挑選膜時需要注意膜的種類、孔徑、結合蛋白的能力等，這些都會影響後續顯著的顏色檢測。

左右滑動看表格
  NC膜 PVDF膜
靈敏度 高 高
背景值 低 低
結合能力 80-100 ug/cm2 100-300 ug/cm2
結合強度 低 高
是否需要活化 不需要 需要甲醇活化
適用實驗 冷光、螢光、常規染色 冷光、commasie blue染色、醣蛋白檢測

 

在裝有轉漬緩衝液的容器中操作，按照 正極（+）｜海綿｜濾紙｜PVDF/NC膜｜膠體｜濾紙｜海綿｜負極（- ) 的順序，在轉印夾中依次放置好。依正極對正極，負極對負極的方向，將轉印夾放入轉漬電極架（轉漬槽可同時放置兩塊 or 四塊轉印夾）

 

 

 

1.用轉膜緩衝液潤洗凝膠，可去除殘留的SDS，同時潤洗的膠更容易與膜貼合，減少氣泡；將PVDF膜慢慢貼膠上，可以用玻璃棒輕輕滾動，以驅趕殘留的氣泡，保證WB條帶乾淨美觀。
2.PVDF 膜使用前需以無水甲醇活化約2min，再浸泡於轉膜緩衝液。可以活化PVDF膜上的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合。盡量避免用手直接接觸PVDF 膜，以免造成污染。
3.轉膜優化方法 大分子蛋白轉膜優化方法：
①對於分子量特別大的蛋白，延長轉膜時間，建議轉膜條件為300 mA，60-90 min或更長，亦可在轉膜液中加入適量SDS至終濃度0.5‰左右，以加強蛋白從凝膠中的釋放；
②轉膜緩衝液中甲醇濃度降到10%或更低，有助於防止蛋白沉澱；
③用4℃濕轉低電流過夜。
小分子蛋白轉膜優化方法：
①SDS妨礙蛋白與膜的結合，可去除緩衝液中的SDS；
②對於常規中小分子量蛋白（25-70 kDa），可選用孔徑0.45 μm的膜，轉膜緩衝液中甲醇濃度20%，建議轉膜條件為300 mA，30 min左右； 對於20 kDa以下小分子量蛋白，建議使用孔徑較小的0.22 μm PVDF膜，轉膜條件為200 mA，20-25 min或300 mA，15-20 min，亦可增加甲醇（可用乙醇取代）含量至25%以加強對凝膠中小分子蛋白的固定作用。

回上層