讓Servicebio成為您的WB實驗小幫手
WB真的是生命科學中研究蛋白質分子傳遞相關的重要實驗，但該注意且不可控的因素真的太多了!
希望這篇文章能幫助到您，讓您的WB跑得更漂亮
一、實驗概述
WB（Western Blot，蛋白免疫印跡）是一種常規的蛋白質分析技術，常用於鑑定某種蛋白，並能對蛋白進行定性和半定量分析。
WB實驗的基本核心概念是抗原抗體的特異性反應，透過SDS-PAGE 將不同分子量的蛋白質分離開，然後轉移到PVDF 膜上，再用脫脂牛奶進行Blocking後，再將抗體用一抗稀釋液進行稀釋。待目的蛋白和抗體充分結合後，用TBST/PBST 洗掉多餘未結合的一抗，加入帶有HRP 標記的對應二抗，這樣，我們的蛋白+一抗+二抗形成一個複合物，加入ECL，有被HPR抓到的蛋白位置就會產生冷光，利用膠片或者冷光成像儀就可以顯現靶蛋白的條帶顯現。
WB常規實驗流程：
蛋白萃取→蛋白定量→製膠→電泳→轉膜→封閉→一抗孵育→一抗洗脫→二抗孵育→二抗洗脫→化學發光→數據分析。
以上繁雜的步驟通常需要2-3天的時間,蛋白質的保存真的是稍縱即逝，所以我們必須搭配良好的試劑與儀器來進行實驗喔!
二、WB實驗試劑配置
RIPA lysis buffer (G2002-100ML或G2033-100ML)
分成強與弱兩種裂解液，讓您針對不同樣本有更好的裂解能力
Phosphoprotease Inhibitor (G2007-1ML)
本產品含有多種磷酸酶抑制劑,可有效抑制Serine、Tyrosine和Threonine、酸性磷酸酶、鹼性磷酸酶等細胞內常見的磷酸酶
Bradford Protein Quantitative Assay Kit (G2001)
Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣本中的化學物質的影響，樣品中β-巰基乙醇的濃度可高達1 mM，二硫蘇糖醇的濃度可高達5 mM；但受略高濃度的去垢劑影響，需確保SDS含量低於0.01%，Triton X-100含量低於0.05%，Tween-20，Tween-600.1en-60.009%。
50× Protease inhibitor Cocktail (G2006-250UL)
含多種蛋白酶抑制劑，該產品會增加單獨的EDTA，供選擇性使用
BCA Protein Quantitative Detection Kit (G2026)
BCA法不受大部分樣品中化學物質的影響，可以相容於樣品中高濃度去垢劑，包括5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween-20、60、80等。
細胞刮勺或組織均質機
針對不同樣本採用不同物理方法進行萃取，可參考我們的另一篇文章『Servicebio WB儀器一條龍 』
三、實驗步驟
A. 組織蛋白萃取
1. 準備所需數量的樣本管；放入研磨珠，置於冰上備用
2. 組織塊先用預冷PBS洗滌2-3 次，除去血以及組織髒汙，然後放在濾紙上，吸盡多餘的PBS 後放入對應的樣本管中，加入約10 倍樣本體積的RIPA lysis buffer (G2002-100ML或G2033-100ML)，置於超低溫組織研磨儀（SWE-FP）中，對稱放置，確認放置平衡後，蓋好蓋子，選擇對應的程序開始研磨組織。
1. 芝麻大小的組織，一般加入100-200uL Lysis buffer；綠豆大小組織加入400-600uL Lysis buffer ；黃豆大小組織加入800-1000uLLysis buffer 。
2. Servicebio組織研磨儀參考參數：2mm 氧化鋯珠8-12顆，頻率6.5m/s，時間30s。若一次研磨不徹底，可以再研磨）。如果組織塊比較大，可提前用剪刀將組織塊剪碎。
B. 懸浮細胞蛋白萃取
1. 將細胞放入15mL 離心管（EP-1501-J）中，4℃，2000rpm，離心5分鐘，去除上清液
2. 加入1mL PBS 溶液（G4202-500ML）回溶細胞，將細胞轉移到1.5mL 離心管（EP-150-M）中，4℃，2000rpm，離心5分鐘，去除上清，保留沉澱，重複此步驟2-3 次（此步驟目的為細胞中殘留的培養基）清洗乾淨
3. 根據細胞沉澱的量加入適量的RIPA lysis buffer，例如沉澱體積為綠豆大小（大概10uL 左右）的加入約200μL RIPA lysis buffer，加入適量研磨珠，放入超低溫組織研磨儀（SWE-FP）進行Lysis；
4. Lysis完成後，12000rpm，4℃，離心10分鐘，上清即為蛋白溶液。
C. 懸浮細胞蛋白萃取
1. 沿著細胞培養盤側面或Flask瓶口慢慢加入PBS 溶液，輕輕晃動平皿或培養瓶，然後將細胞培養盤/瓶傾斜放置，輕輕吸除殘餘液體，盡量輕柔，不要將細胞沖掉，清洗2-3 次，最後一次將殘餘PBS 完全吸乾；
2. 加入適當體積的RIPA lysis buffer（例如6 Well單孔細胞長滿的話，加入約250μL完全裂解液），反覆晃動細胞培養盤/瓶，讓裂解液與細胞完全接觸，用細胞刮勺將細胞刮下來，收集後，可加入研磨珠，放入超低溫組織研磨儀（SWE-FP）中進行更完全的Lysis；
3. Lysis 完成後，12000rpm，4℃，離心10分鐘，上清即為蛋白溶液
D. 蛋白定量
1. 配置BSA標準品，取1 mL蛋白標準配製液加入蛋白標準品（BSA）蛋白標準管中，將25 mg蛋白標準品完全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液。配製成的蛋白標準溶液可-20℃長期保存。
2. 取適量25 mg/mL BSA標準品，以PBS或生理食鹽水稀釋50倍，得到終濃度0.5 mg/mL的蛋白質標準工作液。注意稀釋時依10倍梯度法稀釋，確保稀釋準確。
3. 將蛋白標準工作液分別以0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，再以PBS或生理食鹽水依序加入20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補足至20 μL。得到蛋白濃度依序為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。
4. 將待測的蛋白樣品進行適當稀釋（可透過預實驗檢測，使樣品蛋白濃度在標準曲線範圍內，確保檢測結果可信），並依照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋。
5. 將BCA試劑與硫酸銅溶液依50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。 BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內使用。每個待測樣本需200 μL，建議按需配製，避免浪費。
6. 向標準曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振盪器上振盪30 s），37℃反應30 min後，以標準曲線0號做參比，在562 nm波長下比色測定，記錄各各孔吸光度值。 （註：也可以在室溫反應2 h，或60℃反應30 min。如果蛋白濃度較低，建議置於60℃反應）
7. 以標準曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫座標，吸光值為縱座標，繪出標準曲線。根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得對應孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數即為待測樣品實際蛋白濃度。
